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凍干過程和儲藏過程的變性機(jī)理

2016-03-09

    在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥和貯藏過程中,很多因素(例如,化學(xué)成分、凍結(jié)速率、凍結(jié)和脫水應(yīng)力、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、干燥固體中剩余水分、貯藏環(huán)境的溫度和濕度等)都會影響其中活性組分的穩(wěn)定性甚至?xí)?dǎo)致失活。

大量的實(shí)驗(yàn)研究表明,除了一些食品、人血漿、牛奶等少數(shù)物料可以直接冷凍干燥外;大多數(shù)的藥品和生物制品,都需要添加合適的冷凍干燥保護(hù)劑和添加劑,配制成混合液后,才能進(jìn)行有效的冷凍干燥和貯藏。 

    在生物制品的冷凍干燥過程中,主要有三種效應(yīng)會導(dǎo)致生物制品中活性組分的變性:低溫效應(yīng)、凍結(jié)效應(yīng)和脫水效應(yīng)。

低溫效應(yīng)

     生物制品中活性組分在降溫與復(fù)溫過程的一定溫度范圍內(nèi)會發(fā)生變性。如對卵清蛋白(ovalbumin)的研究發(fā)現(xiàn),在-10℃~-40℃之間,其活性顯著降低,而繼續(xù)降溫到在-192℃,活性幾乎沒有變化。 

凍結(jié)效應(yīng)

 包括離子濃度的增加、冰晶的形成與生長、pH值變化以及相分離等 

  (1)在生物制品的凍結(jié)過程中,不斷結(jié)晶會導(dǎo)致溶液的濃度快速升高。小分子糖在zui大凍結(jié)濃縮基質(zhì)中的計算濃度高達(dá)80%。當(dāng)溶液濃度發(fā)生變化時,離子濃度增加,促進(jìn)了化學(xué)反應(yīng)。

  (2)在生物制品溶液在凍結(jié)過程中也會產(chǎn)生大量的冰-水界面。其中活性組分分子,如蛋白質(zhì),可能會被吸附到界面上,從而可能破壞蛋白質(zhì)的天然褶皺結(jié)構(gòu),zui終導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 

  (3)在有些生物制品溶液的凍結(jié)過程中,溶液的pH值也會發(fā)生變化。如在添加有pH值為7的磷酸鹽緩沖液(NaH2PO4和Na2HPO4的摩爾比為0.72)的蛋白質(zhì)溶液凍結(jié)過程中,由于NaH2PO4的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Na2HPO4,當(dāng)溶液達(dá)到三相共晶點(diǎn)時,它們之間的摩爾比為57,zui終導(dǎo)致了pH值的很大改變。蛋白質(zhì)發(fā)生物理聚集和化學(xué)變性。 

脫水效應(yīng)

(1)水溶液中蛋白質(zhì)經(jīng)過充分水合作用后,在蛋白質(zhì)分子表面附著一單層水,這就是所說的水合層(hydration shell)。一般來講,參與*水合作用的水含量為0.3-0.35g(水)/g(蛋白質(zhì))。而在凍干蛋白質(zhì)產(chǎn)品中水的含量一般不超過10%,因此,必定有一部分結(jié)合水在干燥過程中被除去。

(2)結(jié)合水的去除很可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),zui終導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。這是因?yàn)楦缓Y(jié)合水的蛋白質(zhì)在脫水過程中暴露在乏水環(huán)境中,將質(zhì)子轉(zhuǎn)化為帶電羧酸基團(tuán),破壞了蛋白質(zhì)中電荷平衡,電荷密度的降低可能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子之間的疏水作用,從而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集 。 

儲藏過程

1、蛋白質(zhì)凝聚:是凍干生物制品活性組分在貯藏過程中發(fā)生變性的主要因素之一。導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝集可能是物理(非共價)相互作用,也可能是蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)凝集(共價)。  

2、脫酰胺作用:也是蛋白質(zhì)發(fā)生變性的主要途徑之一。天冬酰胺(Asn)和//33、氨酰胺(Gln)是蛋白質(zhì)中易于發(fā)生脫酰胺作用的兩種氨基酸。

4、非酶褐變:也稱作Maillard反應(yīng)。它使得還原性糖(如葡萄糖)與蛋白質(zhì)中的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)形成碳水絡(luò)合物。 

5、氧化反應(yīng):蛋白質(zhì)中蛋氨酸Met,胱氨酸Cys,組氨酸His,色氨酸Trp和酪氨酸Tyr殘基的側(cè)鏈?zhǔn)前l(fā)生氧化反應(yīng)的可能位置。 

6、水解作用: 雖然凍干的蛋白質(zhì)中含有極少量的水分,但在貯藏過程中仍然會發(fā)生水解作用。 

如前所述,生物制品的冷凍干燥過程是一個多步驟過程,會產(chǎn)生低溫、凍結(jié)和脫水等多種效應(yīng);即使成功完成冷凍干燥過程后,在長期保存過程中也很難保證凍干生物制品活性組分的穩(wěn)定性。為了防止生物制品在冷凍干燥和貯藏過程中活性組分的變性,研究者們研究和探索了大量有效的保護(hù)劑。

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